FORGOT YOUR DETAILS?

تعیین مشخصات آمینواسیدها با طیف سنجی رامان

  توصیف کاربرد  

·         کلید واژه ها: طیف سنجی رامان، آمینو اسید، آنزیم، پروتئین، آلفا آمینو اسید، پراکندگی رامان، طیف سنجی IR 

·         تکنیک مورد استفاده: طیف سنجی رامان

·         حوزه کاربردی:  علوم زیستی، پزشکی

معرفی

اسیدهای آمینه "بلوک های اساسی" هستند که برای تشکیل پروتئین با هم ترکیب می شوند. پروتئین ها از 20 آمینواسید مشابه ساخته می شوند. علاوه بر پروتئین ها، آنزیم ها و دیگر بافت های بدن نیز در طیف گسترده ای از واکنش های شیمیایی شرکت می کنند و در چرخه های تولید انرژی، انتقال انرژی و فعالیت ماهیچه ها نقش بسیار حیاتی دارند.

در بــــــــــــــــدن انــــــــــسان دو نــــوع آمـــــــینو اسیــــــد وجود دارد: آمیـــــــــــــــنو اسیدهای ضروری (که باید در رژیم غذایی مصرف شوند) و آمینو اسیدهای غیر ضروری (که توسط بدن ساخته می شوند). 9 آمینو اسید ضروری بدن انسان عبارتند از: هیستیدین، ایزولوسین، لوسین، لیزین، متیونین، فنیل آلانین، تریئونین، تریپتــــــــــوفان و والــــین و آمینو اسیدهای غیرضروری عبارتند از: آساپاراگین، سیستین،گلوتامین، گلیسین، پرولین، سریــــن و تیروزین. آمینو اسیدهای ضروری بدن انسان توسط گیاهان و موجودات زنده تولید می شوند. در ریشه گیاهانی مانند حبوبات، باکتری "ریزوبیوم" فرایند سنتز آمینو اسید را انجام می دهد.

در حالی تعداد زیادی از اشکال مختلف آمینواسیدها وجود دارد، همه اسیدهای آمینه مهم موجود در موجودات زنده اسیدهای آمینه آلفا هستند. اسیدهای آمینه آلفا، گروه های COOH و NH2 را دارند که هر دو به یک اتم کربن متصل هستند و اتم کربن، آلفا نامیده می شوند. ساده ترین اسید آمینه که گلیسین (H2NCH2COOH) است، هیچ اتم کربن متقارنی ندارد (اتم های کربن چهارضلعی با چهار گروه مختلفِ متصل). بقیه آمینو اسیدها شامل یک اتم کربن نامتقارن هستند و بنابراین از نظر نوری فعال هســـــــــــــــتنـــــــــــد. ساخـــــــــــــــــتار کـــــــــــــــلی آلـــــــــــفا آمـــــــــــینو اســــــــــــــــیـــــــــــــــــــــــدها R CHNH2(alpha) COOH است و فــــعالیت نوریشان پیچیده تر از گلیسین است که کربنِ آلفا نقش مهم را در آن ایفا می کند.

تمامی اسیدهای آمینه که فعال نوری هستند و در بدن موجودات زنده یافت می شوند، اشکال ایزومتریک با فنیل آلانین هستند که در هر دو ایزومتر L و DL دیده می شوند. فقط ایزومرهای L از نظر بیولوژیکی فعال هستند تا بتوانند برهمکنش موفقی با ساختارهای شیمیایی سه بعدیِ پیچیده ی موجود در بدن موجودات زنده داشته باشند.

پپتیدها و پلی پپتیدها نیز بیوپلیمرهای آلفا آمینو اسید هستند که در طبیعت مانند بخش های کوتاهی از پروتئین هستند که طولشان کوتاه مانده است.

علاوه بر اسیدهای آمینه مورد استفاده در تشکیل پروتئین، تعداد زیادی آمینو اسید آزاد یا ترکیب (غیر از ترکیب با پپتیدها یا پروتئین ها) در بدن وجود دارد. آمینواسیدهایی که در تشکیل پروتئین نقش ندارند، عملکردهای دیگری دارند. مثلاً سیترولین و اورتینین در چرخه اوره، تولید انرژی و روند دفع اثرگذار هستند. از طرفی، بسیاری از آمینواسیدهایی که در پروتئین ها یافت می شوند عملکردهای دیگری نیز دارند؛ برای مثال تیروزین در تشکیل هورمون های تیروئید نقش دارد.

نقش هایی که آمینواسیدها در بدن ایفا می کنند، در بسیاری از واکنش های بدن بسیار مهم است. در محلول، اسیدهای آمینه گروه R، روابط ساختاری-عملکردیِ پپتیدها و پروتئین ها را کنترل می کند. به طور کلی، اسیدهای آمینه آبدوست (آن هایی که آمینوی آزاد دارند یا گروه های کربوکسیلی) در قسمت بیرونی پروتئین و مراکز فعال آنزیمیِ پروتئین های فعال یافت می شوند. اسیدهای آمینه گروه های R موجــــــــــب بروز واکنــــــش های آنــــــــــــــزیمی می شوند. توانایی هیستیدین در هموگلوبین برای جلوگیری از ورودی یون های H+ به سلول های سرخرگ ها نیز بسیار مهم است. این ویژگی موجب می شود که هموگلوبین موجود در پوست و ریه ها،  O2 را به CO2 تغییر دهد.

روش:

یکی از فرایندهای مهم در تولید داروهای جدید، تشخیص تعامل مولکول دارو و پروتئین هدف است. اشراف به این موضوع این امکان را به ما می دهد که اصلاحات ساختاری مولکول دارو را به منظور بهینه سازی تولید، انجام دهیم.

روش های زیادی برای تحلیل رفتار پروتئین محلول وجود دارد؛ مانند طیف سنجی فرابنفش، طیف سنجی فلوئورسنس و طیف سنجی دیکروئیک دایروی. دو روش قدیمی برای به دست آوردن اطلاعات ساختاری پروتئین ها و کمپلکس های پروتئین-دارو نیز، روش پرتو X و طیف سنجی NMR هستند. همه این روش ها معایبی دارند:

پراش پرتــــــــــوی ایکس نیاز به آماده ســـــــازی کریـــستالِ تکِ ایده آل دارد که بسیار وقت گیر و در برخی موارد غیر ممکن است. روش طیف سنجی NMR را نیز برای پروتئین های بزرگتر به سادگی نمی توان استفاده کرد. روش دیکروئیک دایروی عمدتاً برای کاوش در زمینه ساختار کلی پروتئین ها استفاده می شود. روش فرابنفش اطلاعاتی درباره ساختار بیرونی پروتئین به ما می دهد. در مورد طیف سنجی فلوئورسنس نیز این مشکل وجود دارد که در صورت حضور مولکول Trp-، سیگنال های موجود در طیف از بین می رود. علاوه بر این، بررسی کمی در این نوع طیف سنجی مشکل است.

طیف سنجی رامان یک روش ارزشمند برای مطالعه مولکول های بیولوژیکی است. طیف سنجی رامان روش اندازه گیری طول موج و شدت نور پراکنده از مولکول ها یا شبکه های کریستــــــــــــالی است. طیف رامانِ مولکول ها در اثر حرکت های ارتـــــــــــــــــــــــــعاشی ایجاد می شــــــــود که تغییرِ قطبش پذیریِ دوقطبیِ مولکولِ تحریک شده باعث به وجود آمدن آن می شود. قوانین انتخاب برای پراکندگی رامان با قوانین جذب فروسرخ متفاوت است. بنابراین در برخی کاربردها، طیف سنجی رامان و فروسرخ تا حدودی از نظر اطلاعاتی که به ما می دهند مکمل یکدیگر هستند.

رامان، پراکندگی ضعیفیست و احتمال بروز آن یک در میلیون است. اجزای اصلی برای گرفتن طیف رامان عبارتند از: یک منبع نور تک رنگ (لیزری) برای تحریک با عرض طیفی از مقیاس یک cm−1، اجزای اپتیکی با توان بالا و یک آشکارساز با نویز پایین.

بحث:

طیف رامان بیشتر مولکول های آلی و همه آمینواسیدها (مانند طیف جذبی IR) کاملاْ مشابه هستند و حدود  cm−1 ۳۵۰۰ را پوشش می دهد. با وجود ظاهر مشابه، همه آمینو اسیدهای جامد، طیف های متفاوتی با یکدیگر دارند و تفاوتشان در جزيیات است که الگوریتم دیتابیس قادر به تشخیص آن است و با توجه به اثر انگشتی بودن طیف رامان همه طیف ها قابل تکرار و متمایز هستند. با این حال نزدیکی قله ها و حساسیت آن ها به تغییرات (به دلیل تغییرات ساختاری)‌ کار کردن با طیف رامان را به ویژه برای ترکیبات سخت می کند. البته این موضوع از نگاهی دیگر بسیار خوشایند است و آن تشخیص های دقیق است.

برای مثـــــــــــــــــال پیوند C-H در ناحـــــــــــــــــــــــــیه  cm−13000 تا cm−1 3100 و پیوند NH2 در آمین های اولیه در ناحیه  cm−1 ۳۳۳۰ تا cm−1 3400 قله ایجاد می کنند. NH3+ در ناحیه cm−13100 یک قله پهن و ضعیف دارد. ساختار حلقه ای ایمیدازول هتروسیلیک دو قله تیز و قوی در cm−1 3110 و cm−13160 دارد. آب نیز یک قله در cm−11600 و یکی در cm−13400 ایجاد می کند. به طور کلی، آب پراکندگی رامان ضعیفی دارد. بنابراین برخلاف روش IR مانع کار نمی شود و عموماً یک حلال ایده آل است. همینطور کربن دی اکسید موجود در هوا مشکلات جذب پس زمینه در اندازه گیری رامان به وجود نمی آورد.

عموماً طیف رامان یک طیف آماده است و برای تحلیل نیاز به دستکاری ندارد و یا تنها تصحیح شکل خط پایه و صاف کردن طیف کفایت می کند. طیف هر ماده نیز یک یا دو قله مشخص دارد که می توان با اطمینان به آن ماده نسبت داد.

جمع بندی:

مزیت طیف سنجی رامان، توانایی آن در به دست آوردن طیف ساختاری از کریستال های تکی در مقیاس میکرومتر است. همچنین وجود آب در نمونه نمی تواند موجب اختلال در نتیجه شود. طیف هر آمینواسید یکتا است. اگر آمینواسیدهای آروماتیک در کنار پروتئین یا آنزیم قرار بگیرند و یا اگر درون ماده دیگری قرار بگیرند، در طیفشان تغییر ایـــــــجاد می شــــــــــــــــــود و این موضـــــــــــــــوع تحلیل را راحــــت تر می کند. بررسی آمینواسیدها به وسیله طیف گیری رامان، اطلاعات خوبی از پروتئین به ما می دهد. به این ترتیب می توان یک بررسی غیرمخرب و کمی از برهمکنش بین دارو و پروتئین داشت. به تمام این مزایا می بایست ارزان بودن خدمات رامان را نیز اضافه نمود.

Source: Jenkins, A. L., Larsen, R. A., & Williams, T. B. (2005). Characterization of amino acids using Raman spectroscopy. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 61(7), 1585–1594. https://doi.org/10.1016/j.saa.2004.11.055

TOP